農藥殘留量測定法

    本方法系用氣相色譜法（通則0521）和質(zhì)譜法（通則 0431）測定藥材、飲片及制劑中部分農藥殘留量。除另有規定外，按下列方法測定。

    對照品貯備溶液的制備  精密稱(chēng)取六六六（BHC）（α-BHC，β-BHC，γ-BHC，δ-BHC）、滴滴涕（DDT） （p，p'-DDE，p，p'-DDD，o，p'-DDT，p，p'-DDT）及五氯硝基苯 （PCNB）農藥對照品適量，用石油醚（60～90℃）分別制成每1ml約含4～5μg的溶液，即得。

    混合對照品貯備溶液的制備  精密量取上述各對照品貯備液0.5ml，置10ml量瓶中，用石油醚（60～90℃）稀釋刻度，搖勻，即得。

    混合對照品溶液的制備  精密量取上述混合對照品貯備液，用石油醚（60～90℃）制成每1L分別含0μg、1μg、5μg、 10μg、50μg、100μg、250μg的溶液，即得。

    供試品溶液的制備  藥材或飲片  取供試品，粉碎成粉末（過(guò)三號篩），取約2g，精密稱(chēng)定，置100ml具塞錐形瓶中，加水20ml浸泡過(guò)夜，精密加丙酮40ml，稱(chēng)定重量，超聲處理30分鐘，放冷，再稱(chēng)定重量，用丙酮補足減失的重量，，稱(chēng)定重量，超聲15分鐘，再稱(chēng)定重量，用二氯甲烷補足減失的重量，靜置（使分層），將有機相迅速移入裝有適量無(wú)水硫酸鈉的100ml具塞錐形瓶中，放置4小時(shí)。精密量取35ml，于40℃水浴上減壓濃縮近干，加少量石油醚（60～90℃），用石油醚（60～90℃）溶解 并轉移10ml具塞刻度離心管中，加石油醚（60～90℃）精密稀釋5ml，小心加入硫酸1ml，振搖1分鐘，離心（3000 轉/分鐘）10分鐘，精密量取上清液2ml，置具刻度的濃縮瓶 （見(jiàn)圖）中，連接旋轉蒸發(fā)器，40℃下（或用氮氣）將溶液濃縮適量，精密稀釋1ml，即得。

    制劑  取供試品，研成細粉（蜜丸切碎，液體直接量?。?，精密稱(chēng)取適量（相當于藥材2g），以下按上述供試品溶液制備法制備，即得供試品溶液。

    測定法  分別精密吸取供試品溶液和與之相對應濃度的混合對照品溶液各1μl，注入氣相色譜儀，按外標法計算供試品中9種有機氯農藥殘留量。

    2.22種有機氯類(lèi)農藥殘留量測定法

    色譜條件及系統適用性試驗  分析柱：以50%苯基50%二甲基聚硅氧烷為固定液的彈性石英毛細管柱（30m×0.25mm×0.25μm），驗證柱：以100%硅氧烷為固定液的彈性石英毛細管柱（30m×0.25mm×0.25μm），63Ni-ECD電子捕獲檢測器。進(jìn)樣口溫度240℃，檢測器溫度300℃，不分流進(jìn)樣，流速為恒壓模式（初始流速為1.3ml/min）。程序升溫：初始70℃，保持1分鐘，每分鐘10℃升180℃，保持5分鐘，再以每分鐘5℃升220℃，后以每分鐘100℃升280℃，保持8分鐘。理論板數按α-BHC計算應不低于1×106，兩個(gè)相鄰色譜峰的分離度應大于1.5。

    對照品貯備溶液的制備  精密稱(chēng)取表1中農藥對照品適量，用異辛烷分別制成如表1中濃度，即得。

    混合對照品貯備溶液的制備  精密量取上述對照品貯備溶液各1ml，置100ml量瓶中，用異辛烷稀釋刻度，搖勻，即得。

    混合對照品溶液的制備  分別精密量取上述混合對照品貯備溶液，用異辛烷制成每1L分別含10μg、20μg、50μg、100μg、200μg、500μg的溶液，即得（其中β-六六六、異、p，p'-滴滴滴、o，p'-滴滴涕每1L分別含20μg、40μg、100μg、200μg、400μg、1000μg）。

    供試品溶液的制備  取供試品，粉碎成粉末（過(guò)三號篩），取約1.5g，精密稱(chēng)定，置于50ml聚苯乙烯具塞離心管中，加入水10ml，混勻，放置2小時(shí)，精密加入乙腈15ml，劇烈振搖提取1分鐘，再加入預先稱(chēng)好的無(wú)水硫酸鎂4g與氯化鈉1g的混合粉末，再次劇烈振搖1分鐘后，離心（4000轉/分鐘）1分鐘。精密吸取上清液10ml，40℃減壓濃縮近干，用環(huán)己烷-乙酸乙酯（1：1）混合溶液分次轉移10ml量瓶中，加環(huán)己烷-乙酸乙酯（1：1）混合溶液刻度，搖勻，轉移預先加入1g無(wú)水硫酸鈉的離心管中，振搖，放置1小時(shí)，離心（必要時(shí)濾過(guò)），取上清液5ml過(guò)凝膠滲透色譜柱（400mm×25mm，內裝BIO-Beads S-X3填料；以環(huán)己烷-乙酸（1：1）混合溶液為流動(dòng)相；流速為每分鐘5.0ml）凈化，收集18～30分鐘的洗脫液，于40℃水浴減壓濃縮近干，加少量正己烷替換兩次，加正己烷1ml使溶解，轉移弗羅里硅土固相萃取小柱[1000mg/6ml，用正己烷-丙酮（95：5）混合溶液10ml和正己烷10ml預洗]上，殘渣用正己烷洗滌3次，每次1ml，洗液轉移同一弗羅里硅土固相萃取小柱上，再用正己烷-丙酮（95：5）混合溶液10ml洗脫，收集全部洗脫液，置氮吹儀上吹近干，加異辛烷定容1ml，渦旋使溶解，即得。

    測定法  分別精密吸取供試品溶液和混合對照品溶液各1μl，注入氣相色譜儀，按外標標準曲線(xiàn)法計算供試品中22種有機氯農藥殘留量。

    限度  除另有規定外，每1kg中藥材或飲片中含總六六六（α-BHC，β-BHC，γ-BHC，δ-BHC之和）不得過(guò)0.2mg；總滴滴涕（p，p'-DDE，p，p'-DDD，o，p'-DDT，p，p'-DDT之和）不得過(guò)0.2mg；五氯硝基苯（Quintozene）不得過(guò)0.1mg；（Hexachlorobenzene）不得過(guò) 0.1mg；七氯（Heptachlor）、順式環(huán)氧七氯（Heptachlor-exo-epoxide）和反式環(huán)氧七氯（Heptachlor-endo-epoxide）之和不得過(guò)0.05mg；（Aldrin）和（Dieldrin）之和不得過(guò)0.05mg；異（Endrin）不得過(guò)0.05mg；順式氯丹（cis-Chlordane）、反式氯丹（trans-Chlordane）和氧化氯丹（oxy-Chlordane）之和不得過(guò)0.05mg； α-硫丹（α-Endosulfan）、β-硫丹（β-Endosulfan）和硫丹硫酸鹽（Endosulfan sulfate）之和不得過(guò)3mg。

    【附注】

    （1）當供試品中有農藥檢出時(shí)，可在驗證柱中確認檢出的結果，再進(jìn)行定量。必要時(shí)，可用氣相色譜--質(zhì)譜法進(jìn)行確證。

    （2）加樣回收率應在70%～120%之間。

    第二法  有機磷類(lèi)農藥殘留量測定法-色譜法

    色譜條件與系統適用性試驗  以50%苯基50%二甲基聚硅氧烷或（5%苯基）甲基聚硅氧烷為固定液的彈性石英毛細管柱（30m×0.25mm×0.25μm），氮磷檢測器（NPD）或火焰光度檢測器（FPD）。進(jìn)樣口溫度220℃，檢測器溫度300℃，不分流進(jìn)樣。程序升溫：初始120℃，每分鐘10℃升200℃，每分鐘5℃升240℃，保持2分鐘，每分鐘20℃升270℃，保持0.5分鐘。理論板數按敵敢畏峰計算應不低于6000，兩個(gè)相鄰色譜峰的分離度應大于1.5。

    混合對照品貯備溶液的制備  分別精密量取上述各對照品貯備溶液1ml，置20ml棕色量瓶中，加乙酸稀釋刻度，搖勻，即得。

    混合對照品溶液的制備  精密量取上述混合對照品貯備溶液，用乙酸制成每1ml含0.1μg、0.5μg、1μg、2μg、 5μg的濃度系列，即得。

    供試品溶液的制備  藥材或飲片  取供試品，粉碎成粉末（過(guò)三號篩），取約5g，精密稱(chēng)定，加無(wú)水硫酸鈉5g，加入乙酸50～100ml，冰浴超聲處理3分鐘，放置，取上層液濾過(guò)，藥渣加入乙酸30～50ml，冰浴超聲處理2分鐘，放置，濾過(guò)，合并兩次濾液，用少量乙酸洗滌濾紙及殘渣，與上述濾液合并。取濾液于40℃以下減壓濃縮近干，用乙酸轉移5ml量瓶中，并稀釋刻度；精密吸取上述溶液1ml，置石墨化炭小柱（250mg/3ml用乙酸乙酯5ml預洗）上，用正己烷-乙酸（1：1）混合溶液5ml洗脫，收集洗脫液，置氮吹儀上濃縮近干，加乙酸定容1ml，渦旋使溶解，即得。

    測定法  分別精密吸取供試品溶液和與之相對應濃度的混合對照品溶液各1μl，注入氣相色譜儀，按外標法計算供試品中12種有機磷農藥殘留量。

    第三法  農藥殘留量測定法-色譜法

    色譜條件與系統適用性試驗  為固定液的彈性石英毛細管柱（30m×0.32mm×0.25μm），63Ni-ECD電子捕獲檢測器。進(jìn)樣口溫度270℃， 檢測器溫度330℃。不分流進(jìn)樣（或根據儀器設置的分流比）。程序升溫：初始160℃，保持1分鐘，每分鐘10℃升278℃，保持0.5分鐘，每分鐘1℃升290℃，保持5分鐘。理論板數按峰計算應不低于105，兩個(gè)相鄰色譜峰的分離度應大于1.5。

    對照品貯備溶液的制備  精密稱(chēng)取、及農藥對照品適量，用石油醚（60～90℃）分別制成每1ml約含20～25μg的溶液，即得。

    混合對照品貯備溶液的制備  精密量取上述各對照品貯備液1ml，置10ml量瓶中，用石油醚（60～90℃）稀釋刻度，搖勻，即得。

    混合對照品溶液的制備  精密量取上述混合對照品貯備液，用石油醚（60～90℃）制成每1L分別含0μg、2μg、8μg、40μg、200μg的溶液，即得。

    供試品溶液的制備  藥材或飲片  取供試品，粉碎成粉末（過(guò)三號篩），取約1～2g，精密稱(chēng)定，置100ml具塞錐形瓶中，加石油醚（60～90℃）-丙酮（4：1）混合溶液30ml，超聲處理15分鐘，濾過(guò)，藥渣再重復上述操作2次后，合并濾液，濾液用適量無(wú)水硫酸鈉脫水后，于40～45℃減壓濃縮近干，用少量石油醚（60～90℃）反復操作丙酮除凈，殘渣用適量石油醚（60～90℃）溶解，置混合小柱[從上下依次為無(wú)水硫酸鈉2g、弗羅里硅土4g、微晶纖維素1g、氧化鋁1g、無(wú)水硫酸鈉2g，用石油 醚（60～90℃）-（4：1）混合溶液20ml預洗]上，用石油醚（60～90℃）-（4：1）混合溶液90ml洗脫，收集洗脫液，于40～45℃減壓濃縮近干，再用石油醚 （60～90℃）3～4ml重復操作除凈，用石油醚（60～90℃）溶解并轉移5ml量瓶中，并稀釋刻度，搖勻， 即得。

    測定法  分別精密吸取供試品溶液和與之相對應濃度的混合對照品溶液各1μl，注入氣相色譜儀，按外標法計算供試品中3種擬。

    第四法 農藥多殘留量測定法-質(zhì)譜法

    1.氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

    色譜條件  以5%苯基甲基聚硅氧烷為固定液的彈性石英毛細管柱（30m×0.25mm×0.25μm色譜柱）。進(jìn)樣口溫度240℃ ，不分流進(jìn)樣。載氣為高純氦氣（He）。進(jìn)樣口為恒壓模式，柱前壓力為146kPa。程序升溫：初始溫度70℃，保持2分鐘，先以每分鐘25℃升溫150℃，再以每分鐘3℃升溫200℃，后以每分鐘8℃升溫280℃，保持10分鐘。

    質(zhì)譜條件  以三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測；離子源為電子轟擊源（EI），離子源溫度230℃。碰撞氣為氮氣或氬氣。質(zhì)譜傳輸接口溫度280℃。質(zhì)譜監測模式為多反應監測（MRM），各化合物參考保留時(shí)間、監測離子對、碰撞電壓 （CE）與檢出限參考值見(jiàn)表2。為提高檢測靈敏度，可根據保留時(shí)間分段監測各農藥。

    對照品貯備溶液的制備  精密稱(chēng)取表2與表4中農藥對照品適量，根據各農藥溶解性加乙腈或甲苯分別制成每1ml含1000μg的溶液，即得（可根據具體農藥的靈敏度適當調整貯備液配制的濃度）。

    內標貯備溶液的制備  取氘代莠去津和氘代對照品適量，精密稱(chēng)定，加乙腈溶解并制成每1ml各含1000μg的混合溶液，即得。

    混合對照品溶液的制備  精密量取上述各對照品貯備液適量，用含0.05%醋酸的乙腈分別制成每1L含100μg和 1000μg的兩種溶液，即得。

    內標溶液的制備  精密量取內標貯備溶液適量，加乙腈制成每1ml含6μg的溶液，即得。

    基質(zhì)混合對照品溶液的制備  取空白基質(zhì)樣品3g，一式6份，同供試品溶液的制備方法處理“置氮吹儀上于40℃水浴濃縮約0.4ml”，分別加入混合對照品溶液 （100μg/L）50μl、 100μl，混合對照品溶液（1000μg/L）50μl、 100μl、200μl、400μl，加乙腈定容1ml，渦旋混勻，用微孔濾膜濾過(guò)（0.22μm），取續濾液，即得系列基質(zhì)混合對照品溶液。

    供試品溶液的制備  藥材或飲片  取供試品，粉碎成粉末（過(guò)三號篩），取約3g，精密稱(chēng)定，置50ml聚苯乙烯具塞離心管中，加入1%冰醋酸溶液15ml，渦旋使藥粉充分浸潤，放置30分鐘，精密加入乙腈15ml與內標溶液100μl，渦旋使混勻，置振蕩器上劇烈振蕩（500次/min）5分鐘，加入無(wú)水硫酸鎂與無(wú)水乙酸鈉的混合粉末（4：1）7.5g，立即搖散，再置振蕩器上劇烈振蕩（500次/min）3分鐘，于冰浴中冷卻10分鐘，離心（4000轉/min） 5分鐘，取上清液9ml，置已預先裝有凈化材料的分散固相萃取凈化管[無(wú)水硫酸鎂900mg，N-丙基乙二胺（PSA）300mg，十八烷基硅烷鍵合硅膠300mg，硅膠300mg，石墨化炭黑90mg]中，渦旋使充分混勻，再置振蕩器上劇烈振蕩（500次/min）5分鐘使凈化*，離心（4000轉/min） 5分鐘，精密吸取上清液5ml，置氮吹儀上于40℃水浴濃縮約0.4ml，加乙腈定容1ml，渦旋混勻，用微孔濾膜（0.22μm）濾過(guò)，取續濾液，即得。

    測定法  精密吸取供試品溶液和基質(zhì)混合對照品溶液各 1μl，注入氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，按內標標準曲線(xiàn)法計算供試品中74種農藥殘留量。

    2.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

    色譜條件  以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（柱長(cháng)15cm，內徑為3mm，粒徑為3.5μm）；以0.1%甲酸（含10mmol/L）溶液為流動(dòng)相A，以乙腈為流動(dòng)相B，下表3進(jìn)行梯度洗脫；柱溫為35℃，流速為0.4ml/min。

    質(zhì)譜條件  以三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測；離子源為電噴霧（ESI）離子源，使用正離子掃描模式。監測模式為多反應監測（MRM），各化合物參考保留時(shí)間、監測離子對、碰撞電壓（CE）和檢出限參考值見(jiàn)表4。為提高檢測靈敏度，可根據保留時(shí)間分段監測各農藥。

    對照品貯備溶液的制備、內標貯備溶液的制備、混合對照品溶液的制備、內標溶液的制備、基質(zhì)混合對照品溶液的制備與供試品溶液的制備  均同氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法項下。

    測定法  分別精密吸取氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法中的供試品溶液和基質(zhì)混合對照品工作溶液各1～10μl（根據檢測要求與儀器靈敏度可適當調整進(jìn)樣量），注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，按內標標準曲線(xiàn)法計算供試品中153種農藥殘留量。

    【附注】（1）依據各品種項下規定的監測農藥種類(lèi)并參考相關(guān)農藥限度規定配制對照品溶液。

    （2）空白基質(zhì)樣品為經(jīng)檢測不含待測農藥的同品種樣品。

    （3）加樣回收率應在70%～120%之間。在方法重現性可獲得的情況下，部分農藥回收率可放寬50%～130%。

    （4）進(jìn)行樣品測定時(shí)，如果檢出色譜峰的保留時(shí)間與對照品一致，并且在扣除背景后的質(zhì)譜圖中，所選擇的監測離子對均出現，而且所選擇的監測離子對峰面積比與對照品的監測離子對峰面積比一致（相對比例>50%，允許±20%偏差；相對比例>20%～50%，允許±25%偏差；相對比例> 10%～20%，允許±30%偏差；相對比例≤10%，允許±50%偏差），則可判斷樣品中存在該農藥。如果不能確證，選用其他監測離子對重新進(jìn)樣確證或選用其他檢測方式的分析儀器進(jìn)行確證。

    （5）氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定的農藥，推薦選擇氘代作為內標；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定的農藥，推薦選擇氘代莠去津作為內標。

    （6）方法提供的監測離子對測定條件為推薦條件，各實(shí)驗室可根據所配置儀器的具體情況作適當調整；在樣品基質(zhì)有測定干擾的情況下，可選用其他監測離子對。

    （7）對于特定農藥或供試品，分散固相萃取凈化管中凈化材料的比例可作適當調整，但須進(jìn)行方法學(xué)考察以確保結果準確。

    （8）在進(jìn)行氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定時(shí)，為進(jìn)一步優(yōu)化方法效能，供試品溶液終定容的溶劑可由乙腈經(jīng)溶劑替換為甲苯（經(jīng)氮吹近干加入甲苯1ml即可）。