凝膠層析分離的一般原理和操作方法

一、目的要求：

1. 學(xué)習與掌握親和層析和凝膠層析分離的一般原理和操作方法。

2. 了解自動(dòng)化純化設備基本組成和原理。

3. 了解親和吸附層析瓊脂糖、凝膠過(guò)濾葡聚糖的基本性質(zhì)。掌握組氨酸標簽蛋白的基本性質(zhì)和純化原理和操作；掌握緩沖液置換和脫鹽的原理和操作。

二、實(shí)驗概述（如右圖）

實(shí)驗步驟：

1. 樣品預處理：即通過(guò)超聲這種細胞破碎的手段，將在大腸桿菌E.coli中表達的重組的帶6個(gè)His標簽的綠色熒光蛋白釋放到相應的緩沖液當中，再通過(guò)離心，0.2微米濾膜過(guò)濾等去除細胞碎片和別的污染物；

2. 組氨酸標簽蛋白親和層析：HisTrapTMHP crude, 1mL預裝層析柱，進(jìn)行親和層析，一步就可以達到90%左右的純度

3. 凝膠過(guò)濾層析脫鹽去除咪唑：HiTrapTM  Desalting 5mL預裝層析柱進(jìn)行脫鹽，置換緩沖液

4. 電泳：對純化過(guò)的樣品的檢測。

三、設備以及試劑準備（試劑均使用化學(xué)純以上）：

1. 儀器：核酸蛋白檢測儀HD系列、自動(dòng)部分收集器BSZ\DBS系列、恒流泵HL系列

2. 樣品：EGFP原液

3. 層析柱：HisTrap HP 1ml, 1根；HiTrap Desalting 5ml，1根

4. 層析緩沖液

5. 注射器，燒杯，負壓脫氣瓶等實(shí)驗室常用容器

四、實(shí)驗內容

1. 儀器和實(shí)驗準備：

所有緩沖液需要過(guò)0.2um膜過(guò)濾，負壓脫氣抽濾瓶脫氣，脫氣裝置如圖所示

樣品預處理：即通過(guò)超聲這種細胞破碎的手段，將在大腸桿菌E.coli中表達的重組的帶6個(gè)His標簽的綠色熒光蛋白釋放到相應的緩沖液當中，再通過(guò)離心，0.45 微米濾膜過(guò)濾等去除細胞碎片和別的污染物；用注射器吸取大于2ml樣品

將注射器內的樣品從樣品環(huán)3號口推入，注意不要將氣泡推入樣品環(huán)(如右圖)。